O filme conta a história sobre monstros que assustam crianças para conseguir seus gritos e gerar energia para seu mundo.

A cidade em que se desenrola boa parte da ação, Monstrópolis - é bem similar ao mundo dos humanos, exceto pelos seus habitantes: monstros, com todos os caracteres - chifres, dentes afiados, cores berrantes, partes do corpo com tamanho desproporcional, pêlos, garras ou aspecto asqueroso.

Mike e Sulley são monstros empregados da firma Monstros S/A (Monsters Inc., no original). Sua tarefa é assustar crianças pequenas todas as noites. Assim, quando as crianças gritam, é armazenada uma certa quantidade de energia, vital para a sobrevivência e a comodidade do mundo dos monstros.

O ponto de contato entre os dois mundos é a porta do armário dos quartos de crianças por toda a Terra. É por esse canal que os monstros invadem momentaneamente o mundo humano, assustam as crianças e depois retornam. A empresa mantém um imenso depósito de portas, e as processa por um sistema industrial e automatizado, qual uma linha de produção. É uma verdadeira fábrica, com turnos, gerentes, recepcionista, vestiários, e etc. A Monstros S/A é responsável pela captação e pela posterior distribuição da energia em Monstrópolis.

Os dois monstros formam uma equipe: Sulley é quem assusta as crianças, e Mike é seu auxiliar - manuseia o equipamento que controla as portas e armazena a energia. Dividem o mesmo apartamento e são muito amigos. Eles são os recordistas da empresa em quantidade de energia armazenada, e participam dos comerciais da companhia. Apesar de sua popularidade, Sulley também conquista algumas rivalidades. A maior delas é com Randall, o qual não se contenta e ser o segundo melhor da empresa e quer bater o recorde de seu rival. malandro e provocador, Randall costuma provocar Sulley e Mike enquanto tenta usurpar a liderança tida por Sulley.

Existe a crença, no mundo dos monstros, de que humanos são potenciais transmissores de doenças. Há uma preocupação, por parte dos monstros assustadores, em evitar ao máximo o contato com os infantes e os objetos que fazem parte de seu quarto. Quando um desses objetos é trazido acidentalmente para o mundo dos monstros, há a adoção de medidas profiláticas urgentes e extremas. O órgão responsável por isso é a CDA - Child Detection Agency.

Acidentalmente, aparece uma garotinha humana no mundo dos monstros. A princípio, a culpa pelo acidente parece ser de Sulley, que havia retornado à linha de produção fora do horário de expediente, a fim de resolver uma pendência burocrática de Mike. No local, ele nota uma porta fora do depósito e resolve abri-la. É surpreendido então por Boo, uma pequena garotinha que com ele passa a brincar.

A reação de Sulley é de espanto e horror. Ele, que todos os dias assustava dezenas de crianças com seu rugido, foge apavorado do pequeno ser de olhos brilhantes e sorriso maroto que o persegue sem cessar, pois o enxerga como um grande e bonito brinquedo com o qual deseja se divertir. Inicialmente, ele a repele como quem repele um ser abjeto, e ela, em sua inocência, é toda ternura para com ele. Com o passar do tempo, o monstro vai se afeiçoando à criança.

A partir daí, Mike e Sulley passam a experimentar grandes e cômicos sobressaltos a fim de encobrir a presença de Boo em Monstrópolis e para devolvê-la a seu mundo. Por fim, eles acabam descobrindo que a presença da garotinha na empresa não fora acidental, mas sim integrava um plano urdido pelo chefe da empresa em conluio com Randall, a fim de aumentar a produção de energia por intermédio de tortura infligida a crianças trazidas para esse fim à fábrica.

Durante a convivência com Boo, Sulley percebe que o riso das crianças gera muito mais energia que o grito de pavor. Uma vez descoberta a trama do chefe, a empresa passa por uma reformulação em seus princípios, e as turmas de assustadores passam a ser de "divertidores". O clima na fábrica também melhora muito, torna-se mais ameno e divertido.